Fragmenty cząsteczek DNA przecięte enzymami BstBI oraz ClaI BspDI nie mogą zostać połączone ze sobą przez ligazę z powodu innych nukleotydów znajdujących się przy końcach 5’ i 3’ rozpoznawanych sekwencji przez te enzymy.
Enzymy restrykcyjne hydrolizują wiązania 3′,5′-fosfodiestrowe.