Aby konstytucja weszła w życie, konieczne było jej ratyfikowanie przez wszystkie 27 krajów członkowskich. Pierwotnie zakładano, że proces ten będzie trwać nawet dwa lata. Obecnie został on zamrożony. W zależności od prawa obowiązującego w poszczególnych państwach, ratyfikacji traktatu dokonywał parlament, prezydent lub naród w drodze referendum.
Większość państw członkowskich konstytucję ratyfikowała. Referenda odbyły się w Hiszpanii, we Francji i w Holandii. Referenda były planowane też w Wielkiej Brytanii i w Polsce, jednak z uwagi na negatywne wyniki referendów we Francji i Holandii do zarządzenia ich nie doszło. W Niemczech i we Włoszech traktat został zaakceptowany przez parlament.
W okresie ratyfikacji obawiano się odrzucenia treści traktatu konstytucyjnego z powodu politycznych sporów, czy hermetycznego języka, w którym dokument został napisany, co miało owocować trudnościami z wytłumaczeniem wyborcom sensu przepisów i spowodować, że referenda przerodzą się w serię plebiscytów dotyczących sympatii do Unii lub lokalnego rządu.
Prezydent Republiki Federalnej Niemiec, Horst Köhler odłożył zatwierdzenie ustawy ratyfikacyjnej na czas orzeczenia niemieckiego Federalnego Trybunału Konstytucyjnego o zgodności tego traktatu z niemiecką Ustawą Zasadniczą. Premier Wielkiej Brytanii Tony Blair ogłosił odwołanie planowanego referendum w sprawie konstytucji. Według wszystkich badań opinii publicznej byłoby ono skazane na pewne fiasko.
Według zwolenników konstytucji opowiedzenie się przez Francuzów przeciw traktatowi miało spowodować osłabienie roli tego kraju w zjednoczonej Europie. Twierdzili oni, że nie ma żadnego Planu B. Rozwój Europy zostanie zawieszony, a przez najbliższe 10 lat obowiązywać będzie traktat nicejski. Przeciwnicy konstytucji twierdzący równocześnie, że popierają Unię, przekonywali o możliwej renegocjacji traktatu na bardziej dla Francji korzystny.
W czasie szczytu UE w Brukseli w czerwcu 2006 roku przywódcy państw członkowskich uzgodnili, że najpóźniej w drugiej połowie 2008 roku podejmą decyzję, w jakim stopniu zmienić projekt unijnej konstytucji. Przywódcy zachęcili osiem krajów, które wstrzymały ratyfikację po podwójnym francusko-holenderskim „nie” dla konstytucji, do ukończenia tego procesu.