W 2. Połowie XVI w Rzeczpospolitej do reformacji przystępowała głównie średnia szlachta - około 1/5 stanu szlacheckiego przeszła na protestantyzm, w tym większość na kalwinizm. Dołączali do niej możnowładcy, w szczególności w Małopolsce i Litwie. Z czasem protestanccy możni zaczęli stanowić liczniejszą grupę niż w przypadku szlachty. W tym okresie często ośrodkami nowych wyznań stawały się w siedziby znaczących rodów, takich jak Oleśniccy czy Radziwiłłowie. Był to szczytowym momentem reformacji w Polsce.
Na ziemiach litewskich kalwinizm był drugim wyznaniem po katolicyzmie. W tym czasie powstało też nowe wyznanie, wyodrębnione z kalwinizmu, którego przedstawiciele byli nazywani braćmi polskimi, arianami lub antytrynitarzami. Podjęto próbę zjednoczenia wyznań protestanckich, zakończoną niepowodzeniem. Jednakże w 1570 roku doszło do podpisania ugody sandomierskiej między kalwinami, luteranami i braćmi czeskimi zakładającej wspólne dążenia na rzecz wolności religijnej i zrównanie praw protestantów z katolikami.
